Подскаите, что нового в области определения токсичности вод (или др. объектов)? Особенно мне интересны биометоды с простейшими организмами? какие способы повышения точности и быстроты метода?
Benycold,
У нас в регионе имеются "Методические указания по биотестированию природных и сточных вод", утвержденные Минэкологии РТ.
Эти указания включают: методики определения острого токсического действия вод при кратковременном биотестировании на ракообразных, водорослях и инфузориях; метод определения хронического токсического действия вод на водорослях.
Я их отправлял сюда на сайт. Посмотрите, они должны быть в разделе "Документы".
Содержание
Введение
1. Общие положения
2. Биотестирование на ракообразных
2.1. Принципы культивирования рачков Daphnia magna Straus и Ceriodaphnia affinis Lilljeborg
2.2. Культивирование хлореллы (корм для рачков)
2.3. Определение устойчивости Daphnia magna Straus к бихромату калия
2.4. Определение устойчивости Ceriodaphnia Affinis к бихромату калия
2.5. Определение токсичности сточной (природной) воды на Daphnia magna
2.6. Определение токсичности сточной (природной) воды на Ceriodaphnia Affinis
3. Биотестирование с использованием водоросли Scenetesmus Quadricauda
3.1. Общие принципы культивирования микроводорослей
3.2. Среда Успенского N 1
3.3. Оценка результатов опыта по определению устойчивости культуры к бихромату калия
3.4. Биотестирование сточной (природной) воды на водоросли Scedesmus Quadricauda
4. Биотестирование на инфузориях
4.1. Принцип методики
4.2. Тестовый организм
4.3. Выделение и культивирование
4.4. Материалы и оборудование
4.5. Отбор и подготовка проб для биотестирования
4.6. Проведение биотестирования
4.7. Обработка и выражение результатов
4.8. Метрологические характеристики
Литература
"...Биотестирование токсичности воды проводят также постановкой лабораторных опытов на чувствительных тест-объектах (дафниях, инфузориях тетрахимена или стилонихия) по ГОСТ СССР ОКСТУ0017 "Вода. Определение токсичности на инфузориях" (1990); "Методическое руководство по биотестированию воды. РД 118-02-90" (1991).
Токсичность нативного патологического материала или экстрактов ядов из органов рыб определяют на лабораторных животных (рыбах, мышах, крысах, кошках, лягушках, насекомых) путем скармливания, парентерального введения или прямого контакта с патматериалом. Выбор животных и методики постановки биопробы зависит от характера предполагаемого ядовитого вещества. Например, при подозрении на пестицидное загрязнение опыты ставят на комнатных мухах, дрозофилах, комарах, используя следующие методы.
Биохимические исследования. Чувствительными индикаторами, отражающими изменения деятельности различных функциональных систем под влиянием токсических веществ, являются содержание сахара в крови, гликогена в печени, белковый спектр сыворотки крови, активность ферментов и др.
Гистологическими исследованиями при отравлениях чаще обнаруживают дистрофические, некробиотические и другие деструктивные изменения в жабрах, паренхиматозных органах, особенно в печени и почках, головном мозге и реже в других органах. Воспалительная реакция при них менее выражена и чаще наблюдается при осложнении токсикозов заразными болезнями.
Постановка биопробы. Для доказательства токсичности загрязненной водной среды ставят биопробу на рыбах непосредственно в водоемах ("рыбная" проба) или в аквариумах. В первом случае опыты ставят в долевых садках, которые устанавливают в водоем, помещают в них чувствительных к токсикантам рыб (окунь, ерш, форель и др.) и ведут наблюдения за их поведением и гибелью в течение 4 - 5 суток. Подобные исследования можно провести в аквариумах или бассейнах, заполнив их водой из водоемов или сточной водой в разных разведениях и др.
Метод сухой пленки. Пестициды извлекают из исследуемого образца ацетоном. Экстракт фильтруют в чашку Петри, испаряют и в чашку помещают 20-30 насекомых. Появление у всех подопытных насекомых нервно-паралитических симптомов и отсутствие их у контрольных указывает на наличие ядохимикатов. Метод кормления. Внутренние органы отравленных рыб растирают в ступке с сахарным песком и скармливают насекомым. Проба считается положительной, если все насекомые погибают с типичными признаками судорог и параличей.
Метод водных взвесей заключается в выдерживании (экспонировании) комаров, дафний, циклопов, инфузорий или рыб в водных суспензиях органов.
Диагноз на отравление рыб ставят комплексно на основании анамнестических, клинических, патологоанатомических данных и результатов лабораторных исследований".
Эколого-физиологические факторы, влияющие на токсичность химических веществ
1. На токсичность химических веществ существенно влияют экологические факторы: температура, газовый состав, жесткость, рН, скорость течения воды и инсоляция.
1.1. С температурой воды тесно связана растворимость химических веществ, и величина их концентраций. Чем выше температура воды, тем больше растворимость большинства ядов и их концентрация в воде. При низкой температуре многие соединения выпадают в осадок, плохо проникают в организм гидробионтов. С другой стороны, температура оказывает неспецифическое влияние на токсикорезистентность рыб, поскольку с ней связана интенсивность обмена веществ и скорость всасывания токсикантов. С подъемом температуры воды повышается чувствительность рыб к ядам, сокращается время проявления симптомов интоксикации и ускоряется гибель. Поэтому концентрации, нетоксичные при низких температурах, могут оказаться летальными при повышенных.
1.2. Дефицит растворенного в воде кислорода приводит к снижению резистентности рыб к различным токсическим воздействиям, так как при этом повышается скорость кровотока в жабрах, что способствует проникновению и накоплению ядовитых веществ в органах и тканях рыб.
1.3. Повышенное содержание углекислоты в водоеме, с одной стороны, изменяет буферные свойства воды и благодаря этому снижает действующую концентрацию вещества, с другой - отрицательно влияет на физиологические функции организма и повышает чувствительность рыб к токсикантам.
1.4. Жесткость воды влияет на токсичность двояко. Высокоминерализованная вода, образуя в основном, с неорганическими веществами, - нерастворимые комплексы, уменьшает действующие на рыб концентрации ядов. В мягкой воде химические вещества хорошо растворяются и их токсичность обычно выше, чем в жесткой. С другой стороны, ионы кальция, уменьшая проницаемость биологических мембран, препятствуют проникновению ядов внутрь организма и тем самым снижают их токсичность.
1.5. Взаимосвязь токсичности и рН воды наиболее четко проявляется у тех веществ, которые могут существовать в ионизированной и неионизированной формах. Так, аммиак при рН 8,0 в 10 раз токсичнее, чем при рН 7,0 за счет резкого повышения концентрации неионизированных молекул (NH3). Действие сероводорода, сульфидов и цианидов усиливается по тому же принципу при сдвиге рН в кислую сторону.
1.6. Из физических факторов следует учитывать скорость течения воды, играющую важную роль в разбавлении и сносе сточных вод, и солнечный свет, ускоряющий их детоксикацию.
2. Чувствительность рыб к ядам сильно варьирует в зависимости от вида, возраста и физиологического состояния организма. Высокочувствительными к токсикантам являются лососевые (радужная и ручьевая форель, лосось), судак, окунь; слабочувствительными - карп, карась, линь, вьюн. Остальные рыбы занимают промежуточное между ними положение. В возрастном аспекте наиболее чувствительны рыбы на стадии эмбриогенеза (гаструляция) и личинки.
3. Неблагоприятные условия среды, голод, скученность рыб, поражение паразитами и другие факторы снижают их устойчивость к токсикантам, и наоборот - загрязнение водоемов снижает резистентность рыб к возбудителям инфекционных и инвазионных болезней и является одной из косвенных причин, вызывающих гибель рыб.
Оценка токсичности мигрирующих веществ методом биотестирования
В качестве биотестобъектов следует использовать дафнии (Daphnia magna Straus), инфузории (Tetrahymena pyriformis), молодь рыб, в частности гуппи (Poecilia reticulata Peters) (5, 6, 26). В качестве дополнительных тест-объектов возможно применение клеточных культур или изолированных органов лабораторных животных.
Неэффективно использование сапрофитной микрофлоры воды в качестве тест-объекта для оценки токсичности мигрирующих в воду соединений.
Биотестирование осуществляется на 1 - 3, 5 - 7, 15 и 30 сутки эксперимента.
При биотестировании с использованием дафний должен проводиться эксперимент с шестивалентным хромом в качестве "внутреннего контроля".
Оценка токсичности мигрирующих в воду веществ осуществляется по вероятностной величине разведения (с ее доверительными границами) изучаемой воды по показателю 50%-ной гибели дафний при 48- и/или 96-часовой экспозиции.
Проведение исследований на дафниях позволяет определить содержание соединений на уровне ПЦК и/или пороговых концентраций хронического действия на человека (для веществ, гигиенические нормативы которых находятся в пределах 0,1 - 10 мг/л).
Высокотоксичные и опасные соединения выявляются только при концентрациях, в сотни раз превышающих их ПДК, поэтому для повышения чувствительности и надежности метода биотестирования на дафниях необходимо предварительное концентрирование проб контактировавшей с полимерным материалом воды. Концентрирование может осуществляться с помощью:
- выпаривания в вакууме,
- вымораживания,
- экстракции органическими растворителями,
- адсорбции/десорбции на активированном угле или полимерных синтетических сорбентах.
Использование таких приемов создает возможность для достижения желаемой степени концентрирования водной вытяжки (до 100 - 200 раз и более). Аналогично опытной пробе параллельно проводится концентрирование контрольной пробы (исходной для приготовления водных вытяжек) воды. При этих условиях биотестирование на дафниях позволяет выявить присутствие в воде абсолютного большинства мигрирующих в воду органических веществ, за исключением некоторых летучих хлорорганических соединений (дихлорэтан, дихлорэтилен, четыреххлористый углерод), которые могут быть выявлены лишь при концентрировании в несколько тысяч или десятков тысяч раз.
Путем разбавления концентрированных проб водной вытяжки, предварительно пропущенной через угольный фильтр водой, устанавливается предел (фактор) разбавления, соответствующий величине 50%-ной гибели дафний при 48 и/или 96-часовой экспозиции. Разбавление проводится последовательно в 2, 4, 8 и т.д. раз, или в соответствии с рядами Фульда:
1,0; 1,8; 3,2; 5,6; 10,0
1,0; 1,7; 2,8; 4,6; 7,7; 13,0
1,0; 1,3; 1,6; 2,0; 3,2; 5,0; 8,0
Концентрирование и разбавление опытной и контрольной проб воды для биотеста на инфузориях проводится по той же схеме, что и при использовании в качестве тест-объекта дафний. Минимальный объем для испытания концентрированных проб воды на дафниях - не менее 10 мг/л. Отсутствие гибели дафний при биотестировании концентрированных проб водной вытяжки и контрольной воды или равные величины полученных ЛК_50 свидетельствуют о том, что в испытуемой водной вытяжке не содержалось соединений в концентрациях, опасных для человека.
Использование при биотестировании других тест-объектов (рыб-гуппи, светящихся микроорганизмов) требуют очень высокой степени концентрирования воды.
Оценка кинетики процесса миграции веществ в воду в зависимости от времени контакта проводится путем построения кривых изменения вероятностных изоэффективных величин разведения, установленных в биотестах для каждого срока наблюдения.